Для поболтать в пятницу. Автоматизация и налоги

основанные на двух принципах: MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) и ESI (Electro Spray Ionization). В методе MALDI фотоны лазерного луча ионизуют и испаряют матрицу мишени, на которую нанесен образец, а
образующиеся из матрицы ионы, как и в методе химической ионизации, ионизуют молекулы образца, не разрушая их. Джон Фенн и Коичи Танака были удостоены Нобелевской премии в 2002 году за разработку методов. К сожалению, эти методы применимы только для анализа биополимеров определенной физико-химической природы и не охватывают широкий круг водонерастворимых протеинов, полисахаридов и ДНК больших молекулярных масс.
Современные методы масс-спектрометрического анализа позволяют детектировать не более половины известных белков и небольшие фрагменты молекул ДНК. Особые трудности возникают при попытках десорбции и получения молекулярных ионов ДНК и полисахаридов. Несмотря на неоднократные попытки десорбции ДНК с твердых поверхностей, успешным оказалось только использование специальных матриц (технология MALDI).
Переведены в газовую фазу наночастицы различной природы: фуллереноподобные структуры молибдена, наночастицы двуокиси кремния, наноалмазы и биополимеры в виде наночастиц. Показано, что зависимость геометрического размера фрагментов ДНК носит линейный характер.

Водородные связи относят к числу слабых химических взаимодействий, для них характерна сравнительно низкая прочность: энергия водородной связи в 5–10 раз ниже, чем энергия химической связи. По энергии водородные связи занимают промежуточное положение между химическими связями и Ван-дер-Ваальсовыми взаимодействиями. Терагерцовое излучение по энергии кванта лежит в области энергий водородных и Ван-дер-ваальсовых связей (~0,01 эВ). Энергия одного кванта излучения на порядки меньше энергии химических связей в молекуле, поэтому энергии терагерцового кванта недостаточно для разрыва ковалентной связи в молекуле, а для разрыва водородной связи достаточно энергии 10 - 100 квантов. Поскольку энергия терагерцового кванта мала, можно ожидать, что в процессе десорбции в газовую фазу будут переходить молекулы, сохранившие ковалентные связи. Такой процесс был действительно обнаружен и назван мягкой неразрушающей абляцией. На данный момент физические механизмы мягкой абляции до конца не ясны. Один из предполагаемых физических механизмов мягкой абляции – поглощение терагерцового излучения водой. Вода, присутствующая между частицами образца, поглощает излучение во вращательной части спектра. Поглощенная энергия переходит из вращательной в поступательную энергию движения молекул, что ведет к увеличению температуры. В конечном счете повышение температуры ведет к ее импульсному испарению, что выводит в газовую фазу часть макромолекул образца вместе с водяными парами.

Для исследования молекул ДНК существует мощный арсенал методов, позволяющих характеризовать как их физико-химические, так и молекулярно-генетические свойства. Современные тенденции использования ДНК в нано- и биотехнологиях ставят задачу разработки новых методов анализа молекул ДНК на основе развивающейся приборной базы. К таким методам, позволившим получить новые знания о молекулах ДНК, относятся в частности атомно-силовая микроскопия и манипулирование единичными молекулами ДНК с помощью лазерного пинцета. Настоящая работа посвящена разработке метода десорбции молекул ДНК с твердых подложек и из жидкой фазы с помощью терагерцового излучения. Перевод ДНК в газовую фазу позволит расширить спектр методов анализа этого биополимера. С молекулами и молекулярными ионами в газовой фазе оперируют методы масс-спектрометрии, спектроскопии, физики аэрозолей, нанотехнологии. Масс-спектрометрия для анализа ДНК используется значительно меньше, чем для анализа белков, как раз в силу сложности получения молекулярных ионов ДНК в газовой фазе. Использование терагерцового излучения для десорбции ДНК позволит переводить в газовую фазу достаточно большие фрагменты, что расширит возможности масс-спектрометрии ДНК.
Одним из самых мощных источников терагерцового излучения является Новосибирский лазер на свободных электронах (ЛСЭ). Характеристики Новосибирского ЛСЭ позволяют проводить уникальные эксперименты по применению терагерцового излучения в научных исследованиях, в том числе и для перевода в газовую фазу и получения молекулярных ионов ДНК.
Проводилась разработка метода перевода в газовую фазу двухцепочечных молекул ДНК больших размеров (три тысячи пар оснований и более) и одноцепочечных молекул ДНК, гибридизованных с олигонуклеотидами на поверхности модельного биочипа, без нарушения их первичной структуры под действием терагерцового излучения для молекулярно-генетического анализа и экспериментов с ДНК в газовой фазе.

Терагерцовое излучение лазера на свободных электронах впервые использовано для исследования ДНК. Проведённое исследование доказывает сохранение способности к передаче наследственной информации, структуры и молекулярно-генетических свойств ДНК после перевода их в газовую фазу с помощью разработанного метода. Впервые показана возможность применения метода для десорбции одноцепочечной целевой ДНК, гибридизованной на модели биочипа. Под действием терагерцового излучения впервые осуществлен перевод различных макромолекул ДНК в газовую фазу, в том числе ДНК больших размеров (три тысячи пар оснований и более). На примере плазмиды pUC18 показано сохранение структуры и молекулярно-генетических свойств ДНК, в том числе способности к трансформации клеток E. coli и репликации своего генома. Таким образом, доказан неразрушающий характер процесса десорбции ДНК с твердых подложек под действием терагерцового излучения с длиной волны 130 мкм, показана применимость метода для десорбции одноцепочечной целевой ДНК, гибридизованной на модели биочипа.
Впервые проведены измерения размеров частиц, образуемых молекулами ДНК в газовой фазе. Установлена зависимость размеров частиц ДНК в газовой фазе от длины взятой ДНК. В диапазоне длин от 6 500 п.н. до 40 000 п.н. получено соответствие размеров частиц ДНК размерам, полученным с помощью теоретического моделирования процесса конденсации и формирования глобулы ДНК.
Перевод ДНК с помощью терагерцового излучения в газовую фазу назван методом мягкой неразрушающей абляции. Открытие явления мягкой неразрушающей абляции признано достижением РАН за 2006 г.

Разработан метод, позволяющий переводить в газовую фазу рекордно большие молекулы ДНК, вплоть до генома фага λ (48 500 п.н.), что открывает широкие возможности для определения размеров и масс ДНК. Созданный в результате работы способ десорбции молекул ДНК может быть использован как для разработки методов масс-спектрометрического анализа генетических макромолекул, так и для применения стандартных методов анализа в газовой фазе к исследованию ДНК.

На основании проведенных исследований, разработаны методические основы анализа целевых ДНК биочипов с помощью метода мягкой неразрушающей абляции. Такая задача представляет интерес с точки зрения совершенствования технологии производства биочипов. В последние годы лавинообразно возросло количество исследований с использованием методов ДНК-биочипов. Однако, сходимость профилей экспрессии, получаемых с использованием биочипов одной направленности различных ведущих мировых производителей, составляет менее 30%. Принципиальная возможность изучать непосредственно результаты гибридизации зондов и мишеней позволила бы получать достоверную информацию о продуктах гибридизации независимым способом. На основе явления мягкой неразрушающей абляции был разработан метод разрушения под действием терагерцовым излучением ДНК-ДНК гибридов на модельной ячейке биочипа и сбора целевой ДНК для последующего анализа.

Для проведения экспериментов была проведена модернизация рабочей станции на Новосибирском ЛСЭ, подобраны параметры излучения Новосибирского ЛСЭ для абляции ДНК, не приводящие к термическому разрушению материала. Были проведены эксперименты с ДНК плазмиды pUC18 (2686 п.н.), ДНК фага Т7 (39936 п.н.), фага λ (48502 п.н.) и фрагментами ДНК фага λ.
Основным доказательством неразрушающего характера мягкой абляции под воздействием терагерцового излучения стал анализ молекулярно-генетических свойств десорбированной ДНК. Для этого использовали ДНК плазмиды pUC18. Аблированную плазмиду собирали на фильтр, элюировали с поверхности фильтра и трансформировали ею компетентные клетки E.coli. Методами клонирования и рестрикционного анализа показано, что в десорбированном материале присутствуют молекулы плазмиды pUC18 сохранившие способность к передаче наследственной информации, обеспечивая устойчивость клеток E.coli к ампициллину. Был проведен гидролиз клонированной после абляции плазмиды ферментами рестрикции EcoR1, Hinf1 и Alw441. Рестрикционный анализ показал, что сайты рестрикции ферментов сохранили свое взаимное расположение и способность связывать фермент рестрикции. На рисунке 1 приведена электрофореграмма гидролизата аблированной плазмиды рестриктазой Alw441. На основании этих данных было сделано предположение, что в результате десорбции методом мягкой неразрушающей абляции ДНК плазмиды pUC18 переходит в аэрозольную фазу, не теряя при этом своих молекулярно-генетических свойств. Для доказательства этого предположения было проведено сравнение последовательностей ДНК нативной pUC18 и ДНК pUC18 после абляции.
Были получены четыре ампликона размерами 517, 971, 1448 и 1510 нуклеотидов с частично перекрывающимися последовательностями с одного клона нативной плазмиды и двух клонов, полученных после абляции. Полученные ампликоны использовали в качестве матриц для секвенирования с прямым и обратным праймерами. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer в Межинститутском центре секвенирования ДНК СО РАН. В результате секвенирования была полностью прочитана последовательность контрольной и аблированной (прошедшей через аэрозольную фазу) плазмиды pUC18. Секвенирование продемонстрировало отсутствие различий между нативной и аблированной плазмидой pUC18. Последовательности исходной плазмиды и плазмиды после абляции совпали на 100%.
Полученные данные свидетельствуют о том, что метод мягкой неразрушающей абляции применим для перевода в газовую (аэрозольную) фазу таких нестабильных биополимеров, как ДНК.
Для визуализации изменений, происходящих с молекулами ДНК в аэрозоле, была проведена атомно-силовая микроскопия (АСМ) препарата ДНК pUC18 до абляции и частиц ДНК, собранных из аэрозоля. По данным АСМ молекулы плазмиды приобрели компактную упорядоченную структуру. С помощью диффузионного спектрометра аэрозолей (ДСА) были проведены измерения размеров частиц, получаемых в газовой фазе при десорбции препарата ДНК pUC18. Размер частиц по данныи ДСА составил 20,7 нм. Сопоставление измерений диффузионных размеров аэрозольных частиц плазмиды pUC18 и измерений с помощью АСМ дают основания предполагать, что в аэрозольной фазе происходит процесс конденсации молекул ДНК. На препаратах видно, что диаметр структур составляет порядка 200 нм, а высота около 10 нм. В газовой фазе наиболее вероятной формой ДНК является глобула. При осаждении частиц ДНК на слюде с помощью вакуумного пробоотборника происходит «распластывание» глобулы по поверхности, поэтому размеры структур на слюде не совпадают с размерами частиц ДНК в газовой фазе. Заметное упорядочивание структуры косвенно свидетельствует в пользу того, что в газовой фазе происходит конденсация ДНК.

В литературе не описано конформационных изменений структуры ДНК или белков под действием электромагнитного излучения в диапазоне 120-235 мкм, однако известно, что, третичная структура молекул в газовой фазе несколько другая, чем в растворах. Согласно закономерностям, предложенным современными моделями процесса конденсации ДНК и формирования глобулы, расчет размеров глобулярной частицы, формируемой линейным полимером приблизительно описывается следующей функцией: R= (N^1/2) * U
Где R –диаметр глобулы, N - количество звеньев цепи, U – длина звена, на котором отсутствует гибкость цепи (сегмент Куна). В случае, когда рассматриваемым полимером является ДНК, минимальный размер сегмента Куна равен длине одной пары оснований, что составляет около 0,35 нм. С увеличением изгибной жёсткости ДНК будет увеличиваться длина куновского сегмента (U) и уменьшаться количество звеньев цепи (N). В случае, когда сегмент Куна содержит n нуклеотидных пар, U = 0.35n (нм), а количество звеньев цепи уменьшится в n раз: N=L/n, где L – длина цепи в нуклеотидных парах. Подставив эти выражения? получим следующую формулу для оценки размеров глобулы: R= ((L/n)^1/2)* 0,35n
Жёсткость молекулы определяется параметром n, с увеличением которого растет размер куновского сегмента и персистентная длина, а количество независимых звеньев уменьшается. Для различных по жёсткости молекул (т.е. при разных значениях n) наклон теоретической кривой будет разным. С увеличением n наклон кривой уменьшается. На рисунке 3 приведен график зависимости размеров глобулы ДНК от длины цепи при значении n равном 3. Точками на рисунке отмечены значения, полученные экспериментально.
Для получения экспериментальных точек электрофоретическим методом из коммерчески доступных препаратов ДНК фага λ, гидролизованной рестриктазами HindIII и BssT1I, были препаративно выделены отдельные фрагменты ДНК-гидролизатов (таблица 1) и проведена мягкая абляция фрагментов ДНК.
Каждый фрагмент и ДНК фагов облучали отдельно терагерцовым излучением с длиной волны 128 мкм. С помощью ДСА были проведены измерения размеров частиц, получаемых в газовой фазе при десорбции препаратов ДНК. Как видно из рисунка 3, четыре экспериментальные точки соответствуют n равному 3. ДНК фага λ формирует глобулу размером меньше теоретически предсказываемого.

Также в меньшую сторону отклоняются размеры частиц, образованных фрагментами ДНК размерами 1500 – 3500 пар оснований. Вероятными причинами этих отклонений может быть как несовершенство предложенной формулы, так и различия в нуклеотидном составе. Таким образом, экспериментально оцененная длина сегмента Куна для ДНК в газовой фазе составляет около 1 нм, что соответствует персистентной длине 0,5 нм.
По литературным данным персистентная длина, измеренная для различных растворов, варьирует от нескольких нанометров до контурной длины ДНК (полностью жёсткая «палка») и определяется поверхностным отрицательным зарядом, распределённым по цепи ДНК. В присутствии катионов отрицательные заряды нейтрализуются, и молекула становится более гибкой. По проведенным нами выше оценкам в газовой фазе персистентная длина ДНК составляет менее 1 нм, что свидетельствует об отсутствии распределённого заряда на поверхности ДНК в газовой фазе и хорошо согласуется с предположением о неионизирующем характере терагерцового излучения.
Полученный результат позволяет сделать два принципиальных вывода. Во-первых, увеличение размеров частиц с увеличением длины, взятой в эксперимент ДНК, свидетельствует о том, что отдельные частицы в аэрозоле соответствуют отдельным молекулам ДНК. Если бы аэрозольные частицы формировались из нескольких цепей ДНК, при определении размеров выявлялись бы частицы, различающиеся в разы: одна молекула ДНК, две, три и т.д. В случае фрагментации молекул не было бы зависимости от длины исходной цепи ДНК. Во-вторых, полученный результат свидетельствует о неразрушающем характере абляции.
Новый способ десорбции ДНК методом мягкой неразрушающей абляции был применён для перевода в газовую фазу синтетической целевой ДНК, связанной на модельной ячейке биочипа. В качестве модели ячейки биочипа использовали круглую пластину кристаллического кремния диаметром 20 мм и толщиной 1 мм с ковалентно пришитыми на поверхность зондами одной и той же структуры (далее – чип).
Принципиальная схема проведения абляции целевой ДНК с гибридизованного чипа под действием излучения ЛСЭ приведена на рисунке 4. Чип, представляющий собой кремниевую пластинку с иммобилизованным олигонуклеотидом (ДНК-зонд) длиной 17 нуклеотидов, гибридизованным с нуклеотидом-образцом (целевой ДНК) длиной 90 нуклеотидов, помещали в стеклянную камеру (А), имеющую три отверстия. Первые два использовались для создания протока транспортёрного газа (сухого азота) через камеру для удаления аблированных частиц и их последующего анализа. Третье отверстие использовали для облучения поверхности чипа терагерцовым излучением.

ДНК, аблированную с чипа, собирали на отдельные фильтры. В каждом случае на фильтр было собрано около 105-106 частиц. На рисунке 5 представлены результаты анализа амплификатов ДНК, собранной из газовой фазы. Для контроля чистоты абляции все процедуры облучения образца, сбора на фильтр, последующей элюции и амплификации были повторены с пустой кремниевой пластиной в качестве образца. На электрофореграмме (рисунок 5) каждый экспериментальный образец и контроль абляции нанесены на две дорожки. Видно, что как при длине волны излучения 126 мкм, так и при длине волны излучения 129,5 мкм перевод молекул целевой ДНК размером 90 нуклеотидов в газовую фазу прошел успешно.
Было проведено секвенирование амплификата аблированной ДНК с использованием Big Dye®-технологии (Applied Biosystems) в Межинститутском центре секвенирования ДНК СО РАН. Сравнение исходной ДНК до гибридизации и после снятия её с гибридизованного чипа методом мягкой неразрушающей абляции показало полную идентичность последовательностей.
Результаты эксперимента окончательно доказывают возможность разрушения ДНК-ДНК гибридов на поверхности биочипа и перевода целевых молекул ДНК в газовую фазу. Таким образом, показана принципиальная возможность снятия целевой ДНК с ячеек реальных биочипов на кремниевой основе.
Водородные связи относят к числу слабых химических взаимодействий, для них характерна сравнительно низкая прочность: энергия водородной связи в 5–10 раз ниже, чем энергия химической связи. По энергии водородные связи занимают промежуточное положение между химическими связями и Ван-дер-Ваальсовыми взаимодействиями. Терагерцовое излучение по энергии кванта лежит в области энергий водородных и Ван-дер-ваальсовых связей. Энергия одного кванта излучения на порядки меньше энергии химических связей в молекуле, следовательно, энергии терагерцового кванта недостаточно для разрыва ковалентной связи в молекуле, а для разрыва водородной связи достаточно энергии 10 - 100 квантов. Поскольку энергия терагерцового кванта мала, можно ожидать, что в процессе десорбции в газовую фазу будут переходить молекулы, сохранившие ковалентные связи. Такой процесс был действительно обнаружен и назван мягкой неразрушающей абляцией.

Измерение размеров ДНК в газовой фазе представляет самостоятельный интерес, поскольку проведено впервые и позволило оценить персистентную длину ДНК в новых условиях. До сих пор такие оценки проводились на основании измерений характеристик молекул, зависящих от их конформации в растворе или с помощью атомно-силовой микроскопии препаратов ДНК на плоскости. В экспериментах были получены частицы ДНК длиной от 1400 п.н. до 48500 п.н. Размеры частиц варьировали от 20 нм до 130 нм. Экспериментально полученные измерения были сопоставлены с моделью Лифшица-Гросберга-Хохлова. В диапазоне длин ДНК от 6 500 п.н. до 40 000 п.н. экспериментальные точки совпали с теоретическим расчетом. Совпадение расчетных и экспериментальных значений подтвердило правильность исходного предположения о том, что в газовой фазе при использовании для десорбции терагерцового лазера с низкой энергией кванта будут преобладать целые молекулы.
Разрушение ДНК-гибрида на поверхности модельного биочипа и десорбция целевых ДНК позволили получить ещё одно доказательство неразрушающего характера процесса. Кроме того, эксперимент с модельным биочипом показал принципиальную возможность использования нового метода для снятия целевой ДНК, гибридизованной на биочипе.
Перевод ДНК в газовую фазу также расширяет спектр методов анализа этого биополимера, в частности, возможности масс-спектрометрии ДНК.

спроси у Кирилла как выглядит твоя активность на форуме, если для тебя так это важно

надеюсь до суши дойдешь